在1936年的秘鲁，考古学家印第安纳·琼斯从一座古庙中寻得宝物查查波亚生育神像，在逃避重重陷阱之后，他撞见了率众多土著人堵截他的考古学家贝洛克，作为琼斯的死对头，贝洛克要他交出金像，经过一番追逐，琼斯搭乘水上飞机顺利脱险。回到美国大学校园的琼斯遇到了两名军方情报人员，后者向他透露纳粹正在寻找琼斯的前导师艾伯纳・雷文伍德，雷文伍德是研究古埃及的权威专家，而纳粹重新发现了塔尼斯，并相信那里隐藏着盛放十诫的约柜。琼斯很清楚纳粹的野心，雷文伍德拥有指示约柜位置的铜帽，而一旦约柜被纳粹得到，获得神秘力量的纳粹军队便将所向披靡、称霸世界。琼斯立即飞抵尼泊尔，却发现雷文伍德已经去世，铜帽由其女儿、琼斯的前女友 玛丽昂·瑞文伍德继承。盖世太保道特率领手下闯进玛丽昂的酒馆，激烈交火之后，大难不死的琼斯带着玛丽昂和铜帽赶赴开罗。两人在开罗找到了经验丰富的埃及挖掘家萨拉，后者知道纳粹的挖掘地点，通过铜帽的指示，他们发现纳粹弄错了方位。琼斯和萨拉招募人手在正确的位置展开挖掘，几小时后，他们挖到了藏有约柜的“灵魂之井”。当害怕毒蛇的琼斯战胜恐惧将约柜弄出神庙时，贝洛克和纳粹闻风而至并劫走了约柜。经过殊死搏斗，琼斯毁掉了纳粹的飞机，夺回了约柜，随即登上开往英国的货船。翌日一早，一艘德国潜艇拦住了货船，贝洛克带走了玛丽昂和约柜，而琼斯也偷偷潜入潜艇，跟随贝洛克等人来到一座荒岛，原来他们希望在将约柜呈交希特勒之前测试一下圣物的威力。琼斯不慎被俘，和玛丽昂绑在一起。贝洛克打开了约柜，琼斯和玛丽昂都紧闭双眼，因为他们知道所有目睹约柜开启的人都难逃一死。转瞬之间，贝洛克和纳粹党羽全都纷纷毙命，伴随着一声惊雷，约柜重又自动关闭。最终，经历了九死一生之后，琼斯终于将约柜完好无损的带回美国 。