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1995年,娜塔莎·罗曼诺夫 ( 斯嘉丽·约翰逊 饰)与养父母和妹妹叶莲娜·贝洛娃 ( 佛罗伦斯·珀 饰)生活在美国俄亥俄州,他们一家是苏联派往美国的特工,娜塔莎自小就接受过特殊的训练。一天晚饭后,娜塔莎的父亲阿列克谢·肖斯塔科夫 ( 大卫·哈伯 饰)要带着一家四口离开美国,就在妈妈梅丽娜·沃斯以科夫 ( 蕾切尔·薇兹 饰)驾驶着飞机驶出车棚时,一辆印有神盾局标识的车辆对他们发起了攻击,并将妈妈打伤。最终,娜塔莎在妈妈的指导下成功将飞机起飞,一家人来到了位于古巴的一处基地。在古巴,娜塔莎和妹妹被送往了秘密的红房子,接受了更为严格的训练。二十多年过去,苏联已经解体,娜塔莎因为在复仇者联盟内战中放走了美国队长而遭到了当局的通缉,但娜塔莎摆脱了追捕,逃到了郊外住下。娜塔莎的妹妹叶莲娜·贝洛娃则在执行一项任务——她要铲除一位叛逃出组织的前黑寡妇,在二人搏斗的过程中,对方释放了一种红色的烟雾,叶莲娜在这种烟雾的作用下恢复了意识,摆脱了控制。前黑寡妇将红色解药交给了叶莲娜,并希望她可以解救所有姐妹,叶莲娜取出了体内的追踪器,接受了这份使命。与此同时,住在郊外的娜塔莎发现燃油用尽,决定进城置办一些日用品,却在回来的路上遭到了袭击,对方是红房子训练的王牌杀手,娜塔莎不是他的对手。但在二人搏斗的过程中,娜塔莎发现对方的目的是为了获取车上的箱子,于是娜塔莎取走了箱子内的东西,佯装被敌人一脚踢下大桥,落入水中。在成功脱困后,娜塔莎看着箱子里放着的红色小瓶子,里面夹着她和妹妹儿时的照片,她明白了这件事和妹妹叶莲娜有关。娜塔莎回到了儿时住的老房子,找到了叶莲娜,但敌人也在这时追了上来,面对众多的红房子手下,娜塔莎和叶莲娜根本不是对手,二人一路逃跑,碰巧掉进了地下商城,娜塔莎二人利用血迹骗过了敌人的追捕。二人摆脱追捕后,就开始想办法寻找训练黑寡妇的红房子地址。她们前往监狱救出了父亲阿列克谢·肖斯塔科夫,又在父亲的指导下找到了母亲梅丽娜,梅丽娜告诉娜塔莎,她的亲生父母并没有抛弃她,而是因为她的基因太优秀,被红房子的人带走,后来娜塔莎的生母为了找回娜塔莎,被红房子的首领杀害。梅丽娜还暗中通知了红房子将几人包围,娜塔莎与梅丽娜趁乱互换了身份,伪装成对方,佯装被麻醉带回了训练黑寡妇的红房子秘密基地,那是一座悬浮在空中的天空之城。这整个基地都是由梅丽娜设计的,因此她和阿列克谢很快逃出了监狱,在梅丽娜的指引下,叶莲娜也成功摆脱了控制。可惜,伪装成梅丽娜的娜塔莎很快就被红房子的首领德雷科夫(雷·温斯通 饰)识破了身份,并发现自己无论是开枪还是拔刀都不忍心伤害德雷科夫,这是因为他体内有一种信息素,所有闻见他体味的人都不忍心对他发起攻击。在二人的对话中,娜塔莎也套取了德雷科夫的秘密,得知他在暗中控制着所有的黑寡妇。娜塔莎猛地将鼻子往桌上一撞,破坏了自己的嗅觉神经,一拳将德雷科夫打倒在地,但在他倒地前,还是开启了一级警戒——所有的警卫和黑寡妇全部出动。数量众多的黑寡妇救出了德雷科夫,将娜塔莎打趴在地,这时叶莲娜及时赶到,将红色解药洒满整个飞机,黑寡妇们恢复了意识。此时,梅丽娜已经破坏了天空之城的引擎,马上就要坠落,梅丽娜、阿列克谢和清醒的黑寡妇们很快成功撤离。在德雷科夫和手下们撤离时,叶莲娜冲上前捅坏了飞机的引擎,飞机炸毁,飞机上的德雷科夫丧生,而叶莲娜也被强大的冲击波冲向了地面,娜塔莎也一同跳了下去,最终娜塔莎一家四口都平安地回到了地面。几年后,娜塔莎离开了人世,叶莲娜将代替她成为新一任黑寡妇 。
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